山階鳥研報(J. Yamashina Inst. Ornithol.), 28: 51-80, 1996(Dec.)
鳥類の生態研究におけるＤＮＡ分析 -- 系統と保全遺伝学を中心に
石田健

〒368 埼玉県秩父市日野田町 1 - 1 - 49
東京大学農学部附属秩父演習林

DNA Analyses in Avian Ecological Studies
- Phylogeny and Conservation Genetics -

Ken ISHIDA
University Forest in Chichibu, the University of Tokyo,
Hinoda-machi, Chichibu, Saitama, 368 Japan

目次
== はじめに==
==I. 生態研究におけるDNA分析 ==
II.鳥類の生態研究における分子系統学と分子遺伝学==

(1) 分子系統学
(2) 分子遺伝学
==III. DNA分析を用いた最近の研究例==
(1) Sibleyのタペストリー：鳥類の系統分類全体の見直し
(2) 系統と進化に関する研究例：
a. 鳥類と他の脊椎動物との系統関係
b. 北米のシルスイキツツキ
c. 北米に広く分布するシジュウカラ属
d. その他の研究例
(3) 分子遺伝学的研究例：
a. オーストラリアの共同繁殖するチメドリの遺伝子流動
b. ベニヒワの遺伝子流動
c. その他の研究
(3)' 保全生物学的な研究例：
a. ホオジロシマアカゲラの遺伝的解析と保全
b. ニシアメリカフクロウの遺伝的多様性の低下
c. その他の希少種の研究
(4) その他の研究例
==IV. DNA分析の主な手法==
(1) DNA-DNA交雑法
(2) いろいろな形で応用される重要な実験手法とその原理
制限酵素によるDNAの断片化
PCR法
RAPD
電気泳動
プローブ
(3)　繰り返し配列を指標とする分析法
繰り返しの回数の違いを比較する方法
DNA指紋（フィンガープリント）法
(4) 塩基配列の違いを検出する方法
塩基配列の決定（シークエンシング）
(5) 分析の対象となるDNA
ミトコンドリアDNA
MHC

==V. 倫理的な配慮と対策==
==VI. DNA研究の今後==
引用文献
添付資料2.
◎野外で鳥類から採血するのに必要な道具や保存液
添付資料2.
◎DNA-DNA交雑法をもとにした世界の鳥のリストの最新情報

Abstract In avian ecology, utilization of molecular techniques, especially DNA polymorphism analyses has been increasing. Current avian molecular studies include three major interrelated approaches; molecular phylogeny, molecular genetics and conservation genetics. This review describes the outline of Sibley's tapestry, examples of the studies utilizing the three approaches, and discusses molecular tools, ethical problems and future possibilities. RFLP of mitochondrial DNA has been most popular method for detecting the polymorphism in the last decade, the PCR-directed sequencing technique, however, and microsatellite DNA and MHC are expected to be important in the near future. Diverse applications of molecular techniques will be also a major future trend in avian ecology and evolution.

Keywords: DNA polymorphism, Ecology, Phylogeny, Genetics, Ethics, Birds.
キーワード：DNA多型, 生態学, 系統学, 遺伝学, 倫理, 鳥類

　　　　　　　　　はじめに[目次へ]
　第20回国際鳥学会議の基調講演で、C.G. Sibley がDNA-DNA交雑法による新しい鳥類分類体系の集大成を紹介した(Sibley 1990, Monroe and Sibley 1993)。４年後の第21回国際鳥学会議の基調講演では、J.C. AviseがDNAを直接研究することの遠大な可能性を遺伝学の立場から示し、この分野の研究の急速な発展ぶりを印象づけた(Avise 1994; Avise 1996; Avise & Hamrick 1996)。その大会会場でも、関連する発表が数多く見られた。私を始めとして、分子生物学的な研究手法を一般的な知識として眺めていただけの野外生態学者にとっても、DNA分析による研究手法が身近なものとなりつつある。
　このレビューは、分子生物学的な研究手法に興味を持っていながら全体像を把握できずにいる、日本の野外鳥類生態学や野鳥の調査・保護活動にたずさわっておられる研究者を主な対象として書く。ここ２～3年の論文を中心に、多くの新しい実例も紹介して、参考文献を見つける役にたつようにしたい。大学や研究所に所属し、文献参照や討論・勉強会の機会に恵まれている研究者にとっては陳腐な内容も多いであろうし、書いたことがすぐ陳腐になってしまう可能性のある研究分野でもある。しかし、研究を進めるにあたっての倫理的な問題や将来の可能性に関する私論は、そうした研究者にとっても参考になることを期待している。私は、この分野の研究における実践的な経験がわずかな研究者であり、的はずれな部分もかなりあると思われる。そうした点に関する忌憚のないご批判をいただければ幸いである。

　　　　　　　　　I. 生態研究におけるDNA分析[目次へ]
　DNA分析を行う目的は、基本的にはまず大きく２つに分けられるだろう。それは、DNAの多様性の分析とDNAの機能発現の機構（メカニズム）の解明とである。前者では、いろいろな生物が持っているDNAそのものを直接的にあるいは間接的に明らかにし、DNAどうしを比較し、DNAの情報から系統樹を作成して進化の歴史を推定したり、生物どうしの類似度を表現したりして、それらと広い意味での表現形質とを比較するという方法がとられる(Avise 1994)。さまざまな意味で、生態学的な研究に直接役立つ研究領域であり、本論説で主に取り上げる課題である。
　後者は、遺伝子の解読や遺伝子操作をともなって、人間の医療とも関連して、多くの研究が行われている。遺伝子の発現機構や個体発生、あるいは生命の起源など生物の根本的なしくみにねざす多様な意味の解明が進められている（石川 1988; 原田 1990; 柴谷ら1994; 佐藤 1994など）。生命の起源のように、もっとも未解明で根本的な生物学的課題もこの中に含まれる(柳川 1994など)。遺伝子の働きの実際のしくみや経過についての理解は、生態学的、進化生物学的な研究にとっても重要な示唆をあたえてくれる。この分野に関しては、寡聞にして野生の鳥類を対象として進化・生態的な側面に直接注目した研究例を知らず、筆者にレビューする力がないので、ここでは割愛させていただく。

　　　　　　　　　II.鳥類の生態研究における分子系統学と分子遺伝学[目次へ]

(1) 分子系統学
　現在、鳥類の研究においても、DNA分析によって分子系統樹の作成を目的としている場合がかなり多い(Avise 1994)。系統解析は、生態学においても、（適応的な形質の）種間比較、種間相互作用の起源や意味、おなじ生物がもっている形質間の関係など、さまざまな課題をより深く理解する上で重要な役割をもっている(Wanntorp et al. 1990; Begon et al. 1996)。系統樹をもっていることが種間比較のためには絶対必要だという意見もよくみられる(粕谷 1995)。それぞれの種の生態が系統の制約をうけ、つまり進化の歴史を背負っていることは生物学のいずれの分野にとっても非常に重要な点であり、最大限注意を払う必要があることはいうまでもない。それを資料の解釈のために利用する上で、進化の歴史をより直接的に表す形である系統樹がより有効なことは確かだ。しかし妥当な系統樹をつくることは、むずかしい作業だったために、最近までやや軽んじられてきた。きちんとした根拠のある系統樹をかけないのであれば系統を無視したのと違いはないという見方もできる(Ricklef 1996)。次善の策として、一般的にうけいれられている分類体系にもとづいて、比較する分類単位を吟味することもひとつの解決策だったし(Clutton-Block 1984)、それは今でも有効な方法のひとつだろう。
　しかし、現在では、DNA解析とコンピュータープログラムによって、特別な熟練や長期間をかけなくても系統解析ができるようになり、系統樹の作成が身近なものになりつつある（長谷川・岸本 1996; 上島 1996）。分子系統樹は、形態や行動などの表現形質を元にした系統樹にくらべて、比較検証する基準がはっきりしており、客観的だと言える（宮田 1994; 長谷川・岸本 1996)。もちろん、それを発表するためには元になるデータや分析方法についての十分な吟味が要求されるが、生態学的な研究の作業仮説を検討するためにも、表現形質を含めたさまざまなデータを用いて系統樹をとりあえずかいてみることは、役に立つだろう。
分子系統樹の作成方法については、上島(1996)に手短かにまとめられている。現在多く用いられる方法を大きくわけると、近隣結合法、最節約法および最尤法の３つがある。近隣結合法は、距離行列法の１つで、比較的計算量を節約しながら、最少進化の基準から系統樹の長さをもっとも短くするように順番に２つずつの分類群を結びつけていく方法である（根井1990)。最節約法は、過去に推定されるDNAの突然変異の回数が最少になるような系統樹を選ぶ方法である。最尤法は、「対象とするデータの生成機構について統計モデルをたて、それを尤度、すなわち得られたデータが生成される確率、の形で表現し、それを最大化する」という理論にもとづいている（長谷川・岸野 1996; p.99 )。　細かい点で異なるさまざまな手法が考案されているが、それぞれに長所と欠点がある。現時点では、生態学の研究者としては、これらの代表的な方法を全て使ってそれぞれの系統樹を描いてみることが勧められる。なお、進化の歴史を最節約的に解釈することの、科学的および哲学的な正当性について考察した書物の訳書が最近出版された（ソーバー 1996)。

　(2) 分子遺伝学[目次へ]
　系統解析とならんで、DNA分析のもうひとつの大きな目的が、個体群の遺伝的構造の解析である(Avise 1994, Shierwater et al. 1994, Avise & Hamrick 1996)。研究手法の発達の歴史からみれば、ヒトやショウジョウバエの集団遺伝学的研究が、DNA分析に関連した研究の背骨となっている（木村 1986, 原田ら 1991)。近年では、特に自然個体群の解析や保全生物学に関係する分野で、鳥類に関する研究も重要な位置を占めている(Haig & Avise 1996)。
　Avise (1996)は、分子遺伝学の研究が鳥類の生態学と進化学において、少なくとも３つの広範な研究領域で近年大きな影響を与えてきたと述べている。それは、繁殖システム、地理的個体群構造と遺伝子流動、および種以上の分類群の系統関係についてである。Avise (1996)達のいう分子遺伝学には、蛋白質やアミノ酸の多型など、DNAを直接分析しない研究手法も入っているが、それをDNAに読み換えても言えることはほぼ同様である。さらにミトコンドリアDNA(mtDNA)の解析を中心とした多くの研究による個体群構造の解析は、応用的な面として、保全遺伝学をさらに活発にしている(Avise & Hamrick 1996, 鷲谷・矢原 1996)。

　　　　　　　　　III. DNA分析を用いた最近の研究例[目次へ]

　この項の説明で用いられるDNA分析の手法や用語の主なものについては、後で解説する。アロザイム（酵素タンパク多型）分析を含めた例を、紹介する。
　主にDNA指紋法やその他の個体識別や近縁関係を明らかにできる手法を用いて、繁殖システムについて行われた研究は、ほとんどが父性を確認する目的でDNA分析を行っている。つまり、ヒナの本当の（遺伝子をもらった）父親がみかけ上の父親（母親のつがい相手）と一致するかどうかを確認し、つがい外交尾の存否やヘルパーの役割などを確認し、父親の適応度を論じている。そのような研究は非常に多数あり、現在も多くの成果が発表されている。これについては、上田(1994)の表１やWestneat & Webster (1994)の付表に研究例の一覧があり、前者には背景となる繁殖生態に関する研究例と知見が広く解説されているので、詳しい説明はそちらを参照していただきたい。

(1) Sibleyのタペストリー：鳥類の系統分類全体の見直し[目次へ]
生態研究の基礎ともなり間接的に関係の深い顕著な業績として、鳥類のほとんどすべての科の系統関係をDNAの類似度をもとにした分子系統学によって再検討して、集大成した、Sibley & Alquist (1990)がある。この比類のない業績は、Sibley のタペストリー（つづれ織り）と通称されている。その結果については、圧倒的な賞賛から厳しい批判まで評価がわかれた。その結果が主に批判される重要な点は、(a) Sibleyらが用いた比較基準である雑種DNAの50%分解温度(ΔT50H)の測定が大きな実験誤差を含む可能性があること、(b) 系統樹作成に用いた距離法はすべての系統での分子進化速度を一定と仮定する方法だが、実際にはその仮定が成り立たないこと、(c) 同じく距離法では、原理的には、系統関係を調べるすべてのグループの１対１の組み合わせによる比較結果を含んでいる必要があるのにそうできていないことなどといった、原理的な問題点である(Harshman 1994, Mooers and Cotgreave 1994)。Sibleyらは1700種もの鳥の個体を実験に用いており、実際問題として100数十のグループ（科）について２つずつのすべての組み合わせ実験をするのはたいへんな労力を要し、全体的な追試は不可能だと言える。
しかし、結果として描かれた鳥類の系統樹の、部分、部分について、その後、DNA交雑法以外の実験法を用いたり、DNA交雑法で追試した結果を進化速度の一定を仮定しない手法で分析した結果では、細かい点で一致しないところがあるものの(Lanyon & Hall 1994)、主要な部分で一致するという結果が多く発表されている(Bleiweiss 1994, Bleiweiss et al 1995, Harshman 1994)。
Sibleyらが作り上げた鳥類の分子系統樹は、ペリカン目がチドリ目と近縁で、ペンギンやサギ類、ワシタカ目まで含む多くのグループが１つにまとまること、アメリカ大陸のコンドルがコウノトリに近縁であることや、アメリカ大陸のゴシキドリ類が旧世界のゴシキドリ類よりもオオハシ類に近縁であることなど、従来の形態にもとづく系統樹、ひいては鳥類の進化の解釈に重要な変更を多く提起した(Sibley 1990)。現在、（種より大きなレベルを対象とした）鳥類系統（分類）学は、Sibleyの系統樹の上で、細かい点の検討と精密化の作業を行っているといえる(Bleiweiss et al. 1994, Lanyon & Hall 1994, Springer et al. 1995, Chikuni et al. 1996など）。Sibley自身が、現在も鳥類の分子系統樹をよりよいものにする努力を続けている（添付資料2参照）。巌佐(1990)は、現実に近い精密なモデルでは実際のデータによって決めなければならないパラメータの数が多くなり、挙動が不安定になるために、かえって単純なモデルの方が事実に近い予想ができる場合が少なくないと述べている。Sibleyのタペストリーも、そのような性質のものに見える。

　(2) 系統と進化に関する研究例：[目次へ]
この範疇の研究は、種よりも上の大きなグループの系統の解明(例 a)と種分化に注目した系統の解析(例 b, c, d)にわけることができる。後者が、より生態研究に密着していると言えよう。種分化や遺伝的特徴の地理的分布等の問題について、日本の周辺の鳥類においても多くの興味深い問題がある(Higuchi et al. 1995)。この分野での分子系統学的なアプローチは、哺乳類ではいくつかの報告が行われているが(増田 1994, 鈴木 1994)、鳥類ではまだほとんどみあたらない（柿沢ら 1996）。

a. 鳥類と他の脊椎動物との系統関係[目次へ]
鳥類が哺乳類に近いのか、爬虫類に近く、ひいては恐竜の直系の子孫なのではないかといった問題は、常に注目を集めてきた問題である（宮田1994, 長谷川・岸野 1996）。Kumazawa & Nishida (1995)は、ミトコンドリアDNA(mtDNA)の中の11のtRNA遺伝子の中の686塩基対(base-pair=bp)にもとづく、ニワトリ(Gallus gallus)、バリケン(Centropus bengalensis)、ヒメコンドル(Cathartes aura)、ダチョウ(Struthio camelus)、ワニ類、トカゲ類、ヤモリ類、ネズミ類、ウシ、カエル類、コイ科といったグループ間の相違を比較して系統樹を書いた。鳥類がワニ類と近縁であるという説を支持する結果になっている。mtDNAのこの部分が脊椎動物の門や綱の間の比較には使えることもしめしている。この研究では、塩基配列の置換による突然変異確率の違いが知られているトランスバージョン（プリンとピリミジン間）とトランジション（プリン同士、ピリミジン同士）を別々に比較している(根井 1990, Wakeley 1996)。そういう分析の難しさを避けるために、遺伝子として蛋白質をコードしている部分では、DNA配列をアミノ酸配列に翻訳してから系統解析をおこなう方法もとられる。

b. 北米のシルスイキツツキ[目次へ]
鳥類には飛翔力があり、渡りをする種も多いためか、他の脊椎動物にくらべて分子レベルでみた個体群どうしの類縁関係が近いらしい(Avise 1996)。北米のキツツキ類でも、セジロコゲラ(Picoides pubescens)などでは広い範囲で比較的均一である(Ball & Avise 1992)。一方で、シルスイキツツキ(Shpyrapicus varius)のようにかつて同一種の著しい地域変異として扱われた、興味深い地理的変異を示す例がある(Howell 1952、図１)。このSphyrapicus属のシルスイキツツキは、現在は、4種にする説と、ムネアカシルスイキツツキ(S. ruber), シルスイキツツキ (S. varius), アカエリシルスイキツツキ (S. nuchalis) の３種は、同種の異所的な個体群とする説とにわかれている(Johnson & Zink 1983)。それぞれ、頭部と胸の羽色の濃さと雌雄差の著しさが異なるが、シルスイキツツキとアカエリシルスイキツツキが似ており、この２種では交雑例も知られている(Short & Morony 1970, Johnson & Johnson 1985)。
Johnson & Zink (1983)は、88個体についてアロザイム分析を行い、39遺伝子座の中の18遺伝視座に多型を見いだした。その結果、アカエリシルスイキツツキは形態的に似ているシルスイキツツキよりも、ムネアカシルスイキツツキに近く、ズグロシルスイキツツキ(S. thyroideus)は他の３種とは遺伝的に明瞭に異なり、この属の古い系統でMelanerpes属から分岐したのだろうという仮説(Short & Morony 1970)を支持した。アカエリシルスイキツツキとムネアカシルスイキツツキの遺伝距離は平均0.004と近く、これは他の多くの亜種のレベルの差だった。アカエリシルスイキツツキとシルスイキツツキのそれは0.029で、多くの例の種間差と同等だった。ズグロシルスイキツツキと他の３種の遺伝的距離は、0.142～0.197と大きかった。
Cicero & Johnson (1995)は、mtＤＮＡのチトクロームｂ領域の711bpの配列をもとに、再度、個体群の類縁関係を推定した。用いた資料は、ムネアカシルスイキツツキ２羽, アカエリシルスイキツツキ２羽, ムネアカシルスイキツツキとアカエリシルスイキツツキの交雑個体１羽, シルスイキツツキ２羽, シマセゲラ(Melanerpes carolinus)１羽とアンデスアレチゲラ(Colaptes rupicola)で、最後の１羽については文献資料の塩基配列を使った。その結果、塩基置換率の種内変異は0.0-0.6%, Sphyrapicus属内の変異（２種どうしのちがい）が0.1-10.2%, Sphyrapicus属と他の２属との変異が12.5%-14.5%となり、これから推定される系統関係はアロザイム分析の結果を支持した。このmtDNAによる系統解析の結果では、Sphyrapicus属は、Colaptes属よりもMelanerpes属に近いことも示唆された。
　これらの結果は、形態的特徴によって推定された系統と、分子系統が一致する場合のよい例で、また鳥類におけるこの領域の塩基配列の相違の程度を示す一例になっている（図2）。

c. 北米に広く分布するシジュウカラ属[目次へ]
Gillら(1993)は、シジュウカラ属６種21 亜種について、mtDNAを11種類の制限酵素で切った断片長の長さの多型で個体群間を、15種類の制限酵素で切った断片で種間の変異を比較した。主として資料を集めたアメリカコガラ(Parus atricapillus)の種内では、ニューファウンドランド島の18個体だけにみられる２種類の多型とそれ以外の地域の64個体にみらる7種類の多型があった（図3）。重みづけをしない２個体群間の遺伝的距離は、0.53±0.23%だった。カロライナコガラ(P. carolinensis)では、分布地域内が完全に東の28個体と西の24個体に分かれた。11の酵素のうち8種類の酵素による多型は東西で異なった（図3）。それぞれ７つずつの多型が得られた。東西それぞれの遺伝的距離は、0.45±0.21%と0.40±0.13%だった。移行地帯で少数の標本を使って、２つの酵素で多型を比較したところ、アラバマ州のトムビックビー川流域付近に境界があると推定された。この３種の遺伝的多様性は、0.46～0.72と計算された。マミジロコガラとメキシココガラのそれぞれ２亜種、カロライナコガラの東西の２集団および他の種間の遺伝的距離は、0.01～0.07の範囲で、平均と標準偏差は0.046±0.012だった。アメリカコガラのニューファウンドランド島の個体群を除いた、従来の亜種が独立性の高い個体群であることは、この研究からは支持されなかった。

d. その他の研究例[目次へ]
Bleiweissら(1994)は、DNA-DNA交雑法で、ユミハシハチドリ亜科４種とシギハシハチドリ亜科4種にエントツアマツバメ(Chaetura pelagica)を加えて系統関係を検討し、この２亜科が単系統的であるという従来の見解を追認した。Leetonら(1994)は、オーストラリアの近縁種であるヒメフクロウインコ(Geopsittacus occidentalis)とキジインコ(Pezoporus wallicus)の他の種との類縁関係を、mtDNAのチトクロームb領域の924bpの塩基配列をもとに確かめ、両種が近縁であることの再確認と、両種がキキョウインコ属(Neophema)およびセキセイインコ属(Melopsittacus)に近いことを示した。キジインコとみかけが似ているカカポ属(Strigops) は近縁でないことがわかった。この研究では、多くの種のDNAをとるのに、標本の羽毛を用いている。
Lougheedら(1993)は、さえずりの地域変異（方言）が著しいことの知られるアカエリシトド(Zonotrichia capensis)において、50kmの間の９ヶ所で、繁殖期に4～7羽ずつの計42羽の雄の成鳥を採集し、mtDNAを14種類の制限酵素で切って、断片長の多型を調べた。その結果、12種類の酵素で、最大10までの多型が現れ、全部で41の多型が認められるという極めて高い遺伝的な多様性を示した。しかし、遺伝的な個体の系統とさえずりの方言の特徴の間には、特定の関係がなかった。Scheiber (1994)は、高地に生息する非スズメ目の多くの鳥類のヘモグロビン遺伝子に、特殊化の収斂が多系統的にみられることを、DNAの塩基配列の解析から示唆した。まだ、詳しい報告が出されていないようだが、そういった興味深い生活史上の特徴の進化をDNAから推定できる一例であろう。Patersonら(1995)は、ペンギン類やアホドリ類など海鳥の、なわばりの持ち方から着地のしかたまで72種類の行動や生活史上の特徴をもとにして描いた系統樹が、ｍtDNAの塩基配列やアロザイム分析をもとにした系統樹とよく似たものになることを示した。
Springerら(1995)は、mtDNAの12S rRNA領域の塩基配列をもとに、メグロ、メジロ科３種、ミツスイ科２種、ハッコウチョウ（ウグイス亜科）などの系統樹を作成し、形態や生態の特徴とも合わせて、メグロがメジロの近縁であることを示した。Zink ら (1995)は、ベーリング海の東西の13種の鳥の個体群で、mtDNAを12種類の制限酵素で切断した断片長の多型を調べ、コガモとツメナガホオジロでは差異がなく、マダラウミスズメ・ミユビゲラ・カササギなど7種では、鳥類で標準的な基準としては別種なみの相違があり、残る6種では種レベルから個体群レベルの差異がみられたと述べているが、まだそのような基準ははっきりしていないと言える。
Chikuni ら (1996)は、ヒタキ科を中心としたスズメ目の20種と、ニワトリ・コゲラなど8種のmtDNAの18SリボゾームRNA領域の塩基配列293bpとチトクロームb領域（コゲラなど4種を除く）の塩基配列646bpをもとに、系統関係を分析した。トラツグミがツグミ属と異なるグループであることや、ルリビタキ・イソヒヨドリ・キビタキの18SリボゾームRNAが同一で、分析した他のスズメ目と異なるグループを形成すること、ムクドリがヒタキ科に近い点などでSibley & Alquist (1990)の結論が追認できることなどが、示された。
Karajewski & King (1996)は、ツル類の全種の20地域個体群を対象として、mtDNAのチトクロームb領域の塩基配列1,143bpをもとに、塩基置換のパターンや系統関係などを分析した。ツルの種・個体群間のこの領域の塩基置換率は0.7-10.7%で、その内トランジションが44.4%-100%をしめること、特に初期の（種）分化過程でコドンの第３位のトランジションの割合が高いこと、ツル類の分子進化速度がスズメ目鳥類よりも遅いことがこの領域でも追認されたことなどが示されている。　これらの研究例が示しているように、最近の種・個体群レベルでのDNA分子系統研究は、昔から注目されている興味深い個体群について、それぞれの時代に最新の技術と理論であった、形態計量系統学やアロザイム分析をおこなった結果と、今日的な分子系統学の新しい結果を対比させ、検証しようとする、いわば伝統的な課題の再検討であり、１つか少数の手法だけによる分子系統からまったく新しい結論をもとめようとするようなものは多くない。最近の傾向としては、mtDNAを用いた近縁種・個体群（亜種）の比較で多くの研究成果が得られている。
　Karajewski & King (1996)の研究は、分子進化の機構を明らかにし、分子系統推定法の改良をはかることが目的である。Cicero & Johnson (1995)も、DNA置換の頻度などについて、その面の分析も行っている。鳥類の一部は、こうした研究の対象としても優れている。

　 (3) 分子遺伝学的研究例：[目次へ]
a. オーストラリアの共同繁殖するチメドリの遺伝子流動
ニューギニア南部から海を越えオーストラリアにかけて分布するヒタキ科チメドリ亜科のオーストラリアマルハシ(Pomatostomus temporalis)は、共同繁殖する。Edwards (1993a)は、比較的血縁度が高く地域個体群間の分散が少ないといわれる共同繁殖する種について、個体群における遺伝子流動や遺伝的構造を確かめるために、この種を調べた。この種の６年間にわたる足環標識による調査でも定着性が高いことが示唆されていた。163個体のオーストラリアマルハシを分布の全域から集め、mtDNAのコントロール領域の一部である領域 I の400bpの塩基配列を、PCR-ダイレクトシーケンス法で調べ、86の配列多型を見いだした。この多型を用いて遺伝的解析をおこなうことによって、集団間の類縁関係を推定したところ、50集団の内5集団で、集団内の塩基配列の多様度が約3%と比較的高い値を示し、1000kmにわたって、わずかながら遺伝子流動があることが判明した。長期間の広範囲にわたる個体の移動（遺伝子流動）が、DNAの分析によって、初めて明らかになったといえる。
Edwards (1993b)は、上とは別に、オーストラリア北部のメルビル島の個体群で44個体を同様の方法で分析し、塩基配列における遺伝的多様性が約2%と、大陸の個体群と同じレベルであることから、この島においても島外との遺伝子流動が、割合に最近あったか現在もあると推定した。

　 b. ベニヒワの遺伝子流動[目次へ]
Seutinら(1995)は、大きな変異があり最近では２種にわけることの多いベニヒワとコベニヒワの広い範囲からの31個体について、mtDNAを20種類の制限酵素による切断で17種類のDNA多型を見いだした。塩基サイトあたりの置換数で評価した集団間の遺伝的距離は0.09%～0.63%で、この最大値は個体群内の個体間の最大値と大差なかった（図4）。DNAの多様性は、個体群間に一様に広がり、伝統的に認められていたこの２種間の差異は、鳥類一般の上種にみられるよりかなり小さかった。
分布域が広く大きな個体群における推定の困難さを前提条件にしながらも、これらの遺伝的多様性を元に有効個体群サイズとして、25,000～45,000羽という推定値も試算されている。先に述べたセジロコゲラなどの場合(Ball & Avise 1992)と同様、広い分布域にわたっても遺伝子流動が十分に大きく、個体群間の構造的差異がないことは、鳥類ではよくあるともいえる。ただ、ベニヒワとコベニヒワの場合には形態の差異から推測されるより遺伝的変異がかなり小さい結果となった。これは、２個体群間の遺伝子流動がたいへん少なく分断していても、有効な全繁殖個体数の多いこのような鳥では祖先からのDNA型が保存されやすく、そのような結果になることはあり得るという。
この研究では、実際には46種類の制限酵素でのmtDNAの断片化を試みており、その内3種類の酵素ではまったく切断できなかった。サンプル間とサンプル内の多型を比較するのに適当な断片長変異のあった20種をもとに上記の結果をえている。これだけ多数の制限酵素を利用すると、このレベルでのmtDNAの多型をかなり抽出でき、塩基配列の決定に近い情報量が得られるといえる。20種類の制限酵素とその断片化の結果が付表にまとめられており、同様の研究をする場合に、参考になる。

c. その他の研究[目次へ]
Smith (1987)は、キバナシマゲラ(Meranerpes aulifrons)とシマセゲラ(M. calorinus)の交雑地帯で、６種類のタンパク多型と形態の比較をもとに、両種が近縁で高い頻度で交雑していることを示した。Zink & Dittmann (1991)は、ホオジロ科トウヒチョウ属(Pipilo)の6種の27羽をもとに、mtDNAを16種類の制限酵素で切断して、196のバンドを検出し、mtDNAの塩基配列の7%を特定し、近縁種４種の間での２種間の平均塩基置換率を6.4%と評価した。ただし、この研究は、この種の研究としてはサンプル数が不十分である。
すでに紹介したLougheedら(1993)のアカエリシトドの研究は、個体群の遺伝的構成を明らかにする側面も持っている。Tarr & Fleischer (1993)は、mtDNAを15種類の制限酵素で切断して多型を調べ、18の多型を見いだし、その内16の多型がハワイミツスイ(Hemignathus virens)のもので、ハワイミツスイ個体群の島間の遺伝的な変異が、通常の種間に相当するぐらい大きいことを見いだした。
　 Austinら(1994)は、オーストラリア南東部の11の繁殖コロニーでハシボソミズナギドリ(Puffinus tenuirostris)のmtDNAを15種類の制限酵素を使って切断し、多くのDNA多型を検出した。コロニー間および、新しく小さいコロニー内と古く大きいコロニー内などでDNAの多様性を比較することによって、コロニー間の個体の移出入が頻繁に起こっていることが示唆された。Ramussen(1994)は、南米のキバナウ(Phalacrocorax atriceps)の地理変異を形態とアロザイムで比較し、個体群間で骨学的な差があるものの、遺伝的な相違が見いだされなかったことを報告した。
Wenikら(1994)は、キョウジョシギとハマシギで、mtDNAのコントロール領域を塩基配列を調べ、２種間の平均的な差異が、その中の部分Iで21.8%、部分IIで7.5%、部分IIIで29.5%であることを示した。キョウジョシギ５個体間では、部分IIIの平均的変異は0.9%、おなじくハマシギでは2.0%だった。世界各地から集めたキョウジョシギ25個体間では、部分Iの平均的変異が0.9%、おなじくハマシギでは3.7%と、特に後者では個体群間の分離が起こっていることが示唆された。両者ともに、16種類の塩基配列の多型が観察された。これによって、この領域の塩基配列の変異が個体群の比較に適していること、ハマシギでは個体群の分離が起こっていることがわかった。
Wood と Krajewski (1996)は、mtDNAの塩基配列1,831bpをもとに、産地の異なる9羽のオオヅル(Garus antigone)と1羽のマナヅル、2羽のオーストラリアヅル(G. rubicund)の遺伝的な比較を行い、鳥類ではほとんど研究されたことのないND6という部位の遺伝的多様性(根井のp)が、オオヅルの種内で0-1%、他種との間ではチトクロームbの3.4-5.0%より大きい4.9-6.4%であったことなどを示した。
これらの結果は、個体群や種の遺伝的構造の全体像を明らかにするにはまだ不十分で、さらに多様な個体群での、より多様な手法や部位における比較が望まれる。いろいろな例が発表され始めており、それらの結果は種の概念自体にも影響を与えつつあり(Zink & McKitrick, 1995)、鳥類を20,000種とする説もでている(Sibley & Alquist 1990; Martin 1996)。

(3)' 保全生物学的な研究例：[目次へ]
　DNA分析の保全生物学上の実例と課題についてはHaig & Avise (1986)に、好例がまとめられている。保全生物学と分子遺伝学の課題は、保全の対照となる分類群（個体群、種、亜種など）の定義に関するものと、もっとも重要な課題としては個体群が小さくなってしまった絶滅危惧種の遺伝的多様性を評価し、絶滅確率を予想しながら保護対策を考えることにある。（集団）遺伝学や系統学の応用分野であると同時に、野生生物においては研究面でも最前線の様相があり、保全生物学的な動機が逆にこの分野の研究の発展を促進している面もある(鷲谷・矢原 1996)。

　a. ホオジロシマアカゲラの遺伝的解析と保全[目次へ]
北米南東部の松林に生息するホオジロシマアカゲラ(Picoides borealis)は、営巣や就塒に適した特殊な木のある森林が減ってしまったために、この100年ほどの間に急減し絶滅危惧種になってしまったキツツキである(Jackson 1994)。ただし、ここ２０～３０年の間にきわめて多くのすぐれた研究が、この種について行われ、低木層の樹木を繁らせないための生息地管理や、緊急を要する場合に人工的な営巣木をつくってやる方法など、個体群を回復させることのできる具体的な保護策が多く見いだされ、実行されている(Walters 1991, Walters et al. 1996)。
Stangelら(1992)は、分布域全体にわたる26の個体群の各2～97個体、全部で442個体をもとにして、アロザイム分析で16の遺伝子座について遺伝的多様度を評価した。個体群の大きさにあるいていど応じて、3.1～10.3%の範囲で、平均7.8%の多型性を示した。その中に、各個体がヘテロ接合の遺伝子座を持っている率は0～25%の範囲で、平均して7.8%だった。生息域別で多型のある遺伝子座の割合は6.3～31.3%で、全部の平均は18.8%だった。生息地間で、ヘテロ接合度に有為な差があった。これらの結果から、ほとんどの個体群が小さいにもかかわらず、少数の極めて小さい個体群を除いて、遺伝的多様性は標準的なレベルに維持されていた。集団間の遺伝的分化の度合い(Fst; 根井 (1990), p.139)は、0.14と比較的高く、独立性のあることを示していた。Haigら(1994a)も、RAPD法によってホオジロシマアカゲラの14の地域個体群の101個体について調べ、遺伝的分化の度合い(Fst)が0.19であるという結果を出した。
ホオジロシマアカゲラは、ヘルパーがおり共同繁殖する。しかし、DNA指紋法で調べたところ、ヒナの両親になっているのは雌雄１羽ずつだけであることが確認され、有効な個体群サイズを計算するときには、一夫一妻の繁殖習性を仮定すべきことがわかった(Haig et al. 1994b)。また、上記したような遺伝的多様性の低い小個体群に、人の手で大きな個体群からこのキツツキを移住させる手法もとられているが、その場合10年間に雌を３羽と雄を2羽移住させるだけで十分であることも、かなり正確な個体群存続可能性分析(PVA)の結果からわかっている(Haig & Avise 1996)。

　b. ニシアメリカフクロウの遺伝的多様性の低下[目次へ]
Barrowclough & Gutierrez R.J. (1990)は、ニシアメリカフクロウ(Strix occidentalis)の7つの地域個体群の107個体の23の対立遺伝子座について遺伝的解析を行って、ニューメキシコの大きな個体群からの９個体で0.022の遺伝子座の変異を得た以外は、まったく遺伝的多様性が見いだせなかった。集団の遺伝分化の度合い(Fst)は、ニューメキシコの９個体を反映して0.55と、ニューメキシコの個体群が別種に相当することを示唆した。もっと多型性の高い部位や検出力の強い分析方法で、個体群の遺伝的構造を調べる必要があるが、このフクロウの遺伝的多様性がほかの種にくらべてかなり低くなってしまっていることは確かである。この種については個体数変動についてのモデルをともなった日本語の解説がある(宮下・藤田 1996)

c. その他の希少種の研究[目次へ]
Miyamoto ら (1994)は、プエルトリコのアンチルバト(Columba inornata)で、DNA指紋法とmtDNAのコントロール領域の塩基配列を調べて、この個体群の遺伝的多様性が非常に低くなっていることを示した。Rhymer ら (1994)は、ニュージーランドのマミジロカルガモ(Anas superciliosa)が、人によって持ち込まれたマガモと交配して、純粋の系統が減ってしまっている遺伝子汚染の情況を、mtDNAを16種類の制限酵素で切断した多型を調べた結果をもとにしめした。このような遺伝子汚染は、雑種をつくりやすい鳥では保全上深刻な問題になりえる。そのような変化を把握するためには、遺伝的な背景の記録や解析もあらかじめ行っておく必要がある。
　なお、このようにDNA分析にもとづくより客観的なデータ分析が、保全生物学上も注目を集めているが、形態や行動などの量的形質によっても、遺伝的多様性やその変化をもとにした有効個体群サイズは推定される（Stofer 1996, 鷲谷・矢原 1996)。特に保全生態学の分野で、絶滅に瀕している個体群の情況を判断する作業は急を要する場合が多く、従来からの手法を含めたいろいろな方法の中から、結果が得られ実施可能性の高いものを選ぶ姿勢も求められる。また、分子データや形態・行動など多面的に遺伝的多様性を評価するほうが、誤りは少なくなる。

(4) その他の研究例[目次へ]
Sabo ら (1994)は、雌雄同形のベニアジサシ(Sterna daugallii)においてW染色体に関する、PCR, RAPDを用いた雌雄判別法を試し、アジサシ(S. hirundo)でもこの手法が使えることがわかった。ベニアジサシでは、第一卵を産んで24時間以内の巣で親鳥を捕獲して調べれば、輸卵管にある卵の有無で雌雄が判別できるが、それ以外の捕獲可能なあらゆる機会にもこの手法によって雌雄が判別できる。この研究では、羽根からとったDNAでの分析も試みたが、血液にくらべて雌雄判別能力が劣った。

　　　　　　　　　IV. DNA分析の主な手法[目次へ]
　DNA分析の主な手法について、日本語で比較的簡単に解説した文章としては深津(1993)がある。ただし、これは、これから可能性の高い手法について思い切った論じ方をしているので、現在でてきている研究成果を理解するのには一部しか役立たない。Avise (1996)には、従来の主な研究手法が、図をともなって説明されている。実験法の解説書には割合に具体的な説明がのっているが、説明はそれぞれにすこしずつ違っており、DNA実験を日常的に行っていない読者にとっては、必ずしも読むだけで理解しやすいものではない（村松 1990; 原田 1991; 藤永 1992; Taylor 1993など)。最近出版された中山(1996)、中山・西方(1996 a, b)は、イラストを多用し、実際に実験をしていない者にとってもかなりわかりやすく、参考になる解説書である。
　DNA分析法の名前（分類）は、分析する部位や分析の技術などいろいろな面を合わせて分類し、つけられている。ここでは、これらの文献をもとに、著者が理解しやすいと感じた図などを引用しながら、鳥類の進化や生態と関係の深い文献によく出てくる分析方法の本質を把握しやすいような説明を試みる。

　(1) DNA-DNA交雑法[目次へ]
　DNA-DNA交雑法では、DNAの相補的な２本鎖の塩基対が弱い水素結合によって結合しており、
　a) 熱っせられると１本ずつのDNA鎖に分離する(鎖の中では切れない）
　b) 熱で分離した１本鎖が冷却されることによってふたたび２本鎖に結合する
　c) また分離したDNAの１本鎖どうしはその塩基対が完全に一致せず、一部が異なって
いても、相補的な塩基対どうしが結合して、雑種のDNAの２本鎖をつくる
　d) 雑種の２本鎖では、完全に相補的になっている本来の２本鎖に比べて、一致してい
ない塩基対の量が多いほど熱に対して弱く一本鎖に分かれやすい
といった原理にもとづいて、雑種DNAの２本鎖の分解する温度を指標として、２種類のDNAの類似度を表わそうとする。原理は単純であるが、実際の実験では、以下のような微妙で細かい実験操作を行う。
　細胞の中にある全DNA（ゲノム；通常は配偶子１個が持つ核DNAの全量, 体細胞はその２倍）を、酵素で小断片に切断した上で熱して１本鎖にし、再び冷やすと、結合する性質の強い繰り返し配列部分がまず急速に２本鎖になるので、２本鎖のみを吸着するハイドロキシアパタイトのフィルターで濾しとって捨てる。比較する２種類のゲノムの内、一方の１本鎖には放射性同位元素で印をつける。これを、ドライバーDNAという。もう一方の一本鎖(トレイサーDNAという）は、ドライバーの500～1000倍ほどの多くの量を用意する。この異なる２種類のDNA１本鎖を低温下で混ぜて結合させると、大部分のドライバーDNAもトレイサーDNAと雑種の2本鎖をつくる。これをふたたび熱しながら2.5度程度間隔で、２本鎖DNAはフィルターで濾しとり、1本鎖に分解して出てきたDNAの量を、放射線を指標として測っていく。
　各温度で得られた１本鎖の量は、温度と対比させたグラフにプロットされる。２種類のDNAの類似度を示す指標としては、通常同一個体のDNA1本鎖における分解速度との差をとって、全体の半分の1本鎖が得られた温度(ΔT50H)、中央温度(ΔTmedianH)、最頻温度(ΔTmodeH)、標準雑種率(NHP; Sheldon & Bledsoe 1989)などがもちいられる。
　この方法を用いた顕著な例が、すでに紹介したSibleyらによる鳥類全体の系統関係の研究である。DNA-DNA交雑法は、比較的良質で多量の試料を必要とし、各手順の温度、溶媒の濃度やドライバーとトレイサーの比率の影響などを排除するための実験条件をそろえる難しさ（あいまいさ）や再現性が必ずしも高くないといった難点などもつきまとうので、将来的には応用範囲の広い手法ではないといえるが、主として種よりも大きな分類単位間の比較に、一部で現在も利用されている(Sheldon et al. 1995)。

　(2) いろいろな形で応用される重要な実験手法とその原理[目次へ]
　制限酵素によるDNAの断片化　制限酵素は２本鎖DNAの特定の塩基配列を認識して、その部分を切断する働きのある酵素で、認識する塩基配列の長さは4つ以上さまざまある。１つだけの塩基配列を認識するものと、複数の塩基配列を認識するものとがある。また、認識する塩基配列が、DNAの中に多数存在する場合には、DNAはその制限酵素によって多数の断片に分断される。原田(1991)には、代表的な制限酵素の一覧表がのっている。DNAを制限酵素で断片化することを、しばしば「消化する」と表現する。
　制限酵素によってDNAを複数の断片に切り分け、その複数の断片の長さの多型を比較する方法(RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism)が、現在までに報告されているDNA分析結果の大部分を占めている。また、適当な数の断片が得られ比較的多型がみつかりやすいことから、鳥類でもほとんどの研究がmtDNAを用いてこの方法が行われてきた。この方法は、情報の損失が大きいので理屈の上では不利だが（深津 1993）、原理や手法が比較的簡便で、多数の制限酵素を用いることによってかなり多くの多型を検出することもできる(Seutin 1995)。また、PCR法で核DNAの一部分を増幅させることによって、mtDNAだけでなくより豊富な多型を検出することは可能である（深津 1993）。

　 PCR法[目次へ]
Polymerase Chain Reaction の略で、たんへん単純な原理だが、少量のDNAサンプルでも大量に増幅させて上質の分析試料をえられる方法である(藤永 1992, Taylor 1993)。もとになる２本鎖DNA、得たいDNAの両端にあたる２種類の短いプライマーと呼ばれる１本鎖DNA、増幅する際の原料となる４種類のデオキシヌクレオシド三燐酸(dNTP)（それぞれA, アデニン、T, チミン、C, シトシン、G, グアニンのどれか一つの塩基を持つ）、それにTaqポリメラーゼという熱に強いDNA合成酵素（１本鎖DNAを鋳型にして、5'末端から3'末端にだけDNAを合成・伸長させるDNAポリメラーゼIの１つ）を混ぜて、まず一定時間加熱する。加熱によって一本鎖にほどかせた後で、今度はこの混ぜものをやや低い温度にしてほどけた鎖をくっつかせる。これをアニーリングという。ただし、ここで鋳型となる原料のDNAの一部は元の鞘にもどるのでなはく、プライマーとつく。その後で、今度は一定時間中間の温度にあげると、酵素の働きで、プライマーから先のDNAが合成されて行き、２種類のプライマーに挟まれたDNA配列が合成される。この、高・低・中という温度にDNAを置く作業を１サイクルとして、何サイクルも繰り返すと、プライマーに挟まれたDNA配列がどんどん増えていく（図5参照）。全部の原料がプライマーとつくわけではなく、いろいろな実験条件にも左右されるが、原理的には１本の原料DNAから、目的とするDNA配列が２サイクル目に１つ、３サイクル目で４つ、ｎサイクル目には2n-1個できる計算になる。nを20とすると10万倍以上にもなる。
　PCRは、少量の原料DNAからでも分析が可能になることから、化石やミイラ、博物館の標本、羽毛や垢などさまざまな資料のDNAを分析できる可能性を生んだ。
　たとえばmtDNAのチトクロームbの部分などでは、多くの動物や生物に共通のプライマーがあり、利用することもできる。また、他の種のプライマーを改造することによって対象とする生物に適したプライマーが作られる。PCRそのものや、プライマーの合成を容易におこなえる機械ができている。現在普及しているPCR自動処理機は、0.2ないし0.5cc程度の小さな容器（マイクロチューブ）を多数入れられる構造になっており、一度に100近い多数のサンプルでも処理できる。前述したように、マイクロサテライトのタンデムリピートを増幅させられるプライマーの開発が、鳥類生態の研究者にとっても、これからの重要課題の１つになる。

　RAPD[目次へ]
ラピッドと発音されるこの方法は、Williamsら(1990)によって最初に紹介された。適当に作った短い配列のプライマーを1つだけ使ってPCRと同様の操作を加え、DNAを増幅させてから電気泳動し、産物の多型を検出する。核DNAから多くの多型が見いだされ、前提が単純で、実験操作自体は手軽なことが利点で血縁度の推定などに一部で普及しつつあるようだが、資料の調整や温度条件・試薬の濃度などの条件を厳しくそろえる必要があるなどの難しい点も多く指摘されており(Scott & Williams 1994)、DNA指紋法同様にゲノムのどこを調べているのか不明であり、解釈の曖昧さを残すのではないかと著者は懐疑的にみている。しかし、パターンは比較的メンデル遺伝するということで(Williams et al. 1990)、子世代と親世代の遺伝的な関係（親子関係、遺伝的多様性の変化、雑種形成など）をとりあえず見るには使えるようである。

　電気泳動[目次へ]
　DNA断片は負に帯電しているので、DNAの断片の入った溶媒を、電解液を含む純度の高い寒天（アガロース )・ゲルやポリアクリルアミド・ゲルの一端に開けた小さな穴に入れ、電圧をかけると、ゲルの中を陽極の方へ引かれて移動する。分子量の小さい断片は速く、大きい断片はゆっくり移動するので、分子量が既知のDNAとならべて電気泳動すればDNAの分子量が推定でき、また断片の大小の違いが帯（バンド）のパターンとして識別できる。DNAや蛋白質の分析に広く利用されている。
　電気泳動したDNAの断片が見えるようにするには、通常、DNAの鎖の隙間に入るエチジウムブロマイドで染色して、紫外線をあてて観察する。なお、エチジウムブロマイドは強い発ガン性物質である。
プローブ[目次へ]
　特定の塩基配列（のあるDNA断片）を検出するために、印をつけたDNA断片をプローブという。印として見えるようにするために放射性同位元素（アイソトープ）が用いられているが、近年は、化学発光や蛍光・免疫染色などにより検出する方法も用いられる。それぞれ一長一短があるが、放射性物質を反応させるよりも安全性は高い。
　プローブは、一本鎖にして、電気泳動したDNA断片と2本鎖に結合させ、そのバンドだけが判別できるようにする。

　(3)　繰り返し配列を指標とする分析法[目次へ]
　繰り返しの回数の違いを比較する方法　DNAの中には、10～60個程度の単位の同じ塩基配列がくりかえしてつらなっている部分があり、それはミニサテライトと呼ばれている。その繰り返しの回数には変異がある(VNTR = Variable Number of Tandem Repeat)。類似した塩基配列を単位とするミニサテライトは、ゲノムのなかに多数ある。さらに、2～数個と、ミニサテライトよりも小さい単位の塩基配列が繰り返しつらなっている、マイクロサテライトと呼ばれる繰り返し配列の部分も見つかっており、その繰り返し回数は、ミニサテライト以上に著しい変異があり、多型性が高い。ヒトでは、76もの多型を持つ座位も見つかっている。
　ミニサテライトの塩基配列は変異性が高く、その変異量から計算すると、この部分の突然変異率は１世代・１つらなり（タンデムリピート）あたり10-2～10-4程度と、きわめて高い。極端な場合には、5%くらいのことまである(Ashley & Dow 1994)。マイクロサテライトの（みかけ上の）突然変異率は、ミニサテライトよりも低く、1世代・１つらなりあたり10-4～10-5程度だと推定されている(Ashley & Dow 1994, 矢原私信)。
マイクロサテライトのゲノムの特定の部位だけにつくシングルローカス・プローブがあり、上記したような特定のタンデムリピートの近くにつくようなシングルローカス・プローブがえられれば、その分類群での研究は進みやすくなる。
VNTRの多型性の分析は、今後、多くの可能性をもっているが、適切なシングルローカス・プローブは種（あるいは特定の集団）に特異的であり、その開発に時間と労力が必要である。マイクロサテライトは、後述のPCR法によって、ごく微量の試料から増幅されることが容易で、その意味で新たな可能性を秘めている。

　DNA指紋（フィンガープリント）法[目次へ]
DNA指紋法は、Krebs & Davies (1993)にも紹介され、生態学や行動学の分野で広く応用されている分析法になった。その国際学会もある。
この名称は、元来は、サザンハイブリダイゼーションと呼ばれる分析法をミニサテライトに当てはめ、特殊なプローブを用いて多数のバンドを検出する手法を指す(Jeffreys et al. 1985)。まず、制限酵素で分断したゲノムの断片を電気泳動でゲル上に分離したあと、ナイロン膜に移し取る。多くのミニサテライトに共通する塩基配列（コア配列）に相当する塩基配列を用意して、それをプローブとして、熱を加えてナイロン膜に取ったDNAとハイブリダイズさせ、検出する。その結果ほとんどの個体で異なる特徴のバンドパターンがでてくる。あたかもヒトの指紋のように個体の違いを区別できるとともに、その特徴があるていどメンデル遺伝するので、それをもとに親子関係なども推定できる。これが、DNA指紋法である。
DNA指紋法で用いるプローブは、マルチローカスプローブと呼ばれる、いろいろなDNA領域にあるミニサテライト部位につく配列をもったDNA断片なので、20個程度の複数のバンドがゲル上に現れる。
マルチローカス・プローブは、ゲノムのどの部分についたかを実際に特定することはできない。そのためもあり、突然変異確率がきちんとした根拠で計算できない。これらのことは遺伝的な解析をする上であいまいさを残す。また、出現バンド数が多すぎるために、実験条件によってプローブのハイブリダイズのていどなどが変わり、１回の電気泳動ごとの同一ゲル上以外でのバンドパターンの比較は、信頼性が低い。
Westneat & Webster (1994)によってまとめられた1994年初頭までに発表された鳥類の血縁度に関する主な論文の内、アロザイム分析を用いたものが25、RFLPが3、シングルローカスミニサテライトとマイクロサテライトが各1に対して、マルチローカス・ミニサテライトを用いたものが63紹介されている。しかし、鳥類の個体識別や血縁度の推定においては、より確実性のある、シングルローカスプローブを用いたサザンハイブリダイゼーションや、後述するマイクロサテライトを用いた分析方法が、現在では主流になりつつあり、簡便さから時にはRAPDも用いられており、動物行動学の研究者はそれらを総称して"fingerprinting"と呼んでいる（Krawczak & Schmidtke 1994, 永田私信）。

　(4) 塩基配列の違いを検出する方法[目次へ]
　塩基配列の決定（シークエンシング）
　DNAの塩基配列を直接読むことによって、直接、DNAの多様度が評価でき、またすでにある世界的なDNAデータベースや文献の塩基配列と直接対照させて、遺伝的多様性や系統樹を分析することが可能である。その方法には、主に２種類あるが、現在多く用いられるのは、ジデオキシ法（またはサンガー法）と呼ばれる手法である。
　PCRの項で述べたDNAポリメラーゼI、プライマーと鋳型DNA、４種類のdNTPの外に、それらのどれか１つに対応してDNAの伸長を止めてしまう働きのあるジデオキシヌクレオシド三燐酸(ddNTP)の内の１つ、を混ぜておく。混ぜものをまず熱してDNAを一本鎖にしてから、より低温に保っておくと、プライマーから先のDNAが合成されていく。ddNTPがつけばそこで合成はおわり、dNTPがつけばさらに伸長していく。その結果として、４種類のddNTPを混ぜたそれぞれの反応液で、A, T, C, G それぞれのところで切れた長さのちがうさまざまなDNAが合成されることになる。その４種類のまぜものでできたDNAを標識して並べて電気泳動にかければ、もとの鋳型DNA上の塩基と相補的な塩基の順にバンドが現れることになる。それをそのまま読んでいけば、塩基配列がわかる仕組みである。　まだ高価だが、電気泳動と同時に塩基配列を自動的に読んでくれる機械（シークエンサ）が普及しつつある。シーケンシングの前には通常PCRを行うが、PCRに使うTaqポリメラーゼもシークエンシングに使えるので、いずれ、PCRとシークエンシング反応を一ぺんに（機械に）やらせてしまうことも実用化するだろう。この手法は、機械による自動化とその機械の普及が徐々に進んでおり、将来はより手軽なものになると期待される。
　多数(しばしば100以上）のサンプルについて分析する必要のある生態学者にとって、塩基配列を決めるこの分析方法は「まだ」現実的でないという深津(1993)の指摘は、Edwards (1993a, b)のような研究成果が出てきている今や、すでに昔のものになりつつあるのかもしれない。

　 (5) 分析の対象となるDNA[目次へ]
　ミトコンドリアDNA
ミトコンドリアは環状の２本鎖で、大部分はリボゾームRNAや転移RNAなどをコードするが、コントロール領域の中のDループと呼ばれる部分のように遺伝子の機能がない部分もある。多細胞動物mtDNAの大きさはほとんどが16kb(キロ塩基対) 前後だと言われており(根井 1990)、ホオジロ科で16.7-16.8kb (Zink & Dittmann 1991)、ユミハシハワイミツスイ属で16.7kb前後 (Tarr & Fleischer 1993)、ベニヒワで約17.2kb (Seutin et al. 1995)、シジュウカラ属で約16.6kb (Gill et al. 1993), ヒトで約16.5kb (原田ら 1991, Avise 1994)、哺乳類では約16kb(中澤・浅見 1995)などと、核DNAや植物のmtDNAなどにくらべて小さく扱いやすいこともあり、脊椎動物（両生類は比較的大きい）の個体群の構造解析や近縁の集団間の系統解析に近年よく使われている。核DNAに比べ進化速度が比較的早く、Dループは他の領域に比べて塩基配列の変異が大きいなど、mtDNA内の部位による進化速度の比較も行われている(Edwards & Wilson 1990, Seutin et al. 1994)。
　鳥類では10年余り前から応用され始め(Kessler & Avise 1985)、研究例で紹介したように、ここ２～３年に北米の鳥学雑誌を中心に近縁分類群の系統をとりあげた論文の相当部分が、mtDNAを制限酵素で切断した断片長の多型から、種間や個体群間の類縁関係を論じている(Moore 1995)。この方法には、かなりの情報の無駄があるので(深津 1994)、今後は、Edwards (1993a, b)やWenikら (1994)が用いたようなPCR-シークエンスという方法が主流になっていくであろう。mtDNA自体は、今までの研究の蓄積があって対照させらる資料が多くそろっており、扱いやすさもあって、今後も系統分析に利用する価値が高い。
　なお、ミトコンドリアは細胞質にあり、そのほとんどが母親の卵細胞を通して子に受け継がれる。遺伝子流動や突然変異率を考慮する必要がある場合には、この点に注意する必要がある。また、核DNAにmtDNAの一部と同じ塩基配列があったり(Quinn & White 1987, Smith et al. 1992, Zhang & Hewit 1996)、 DNAデータベースに登録されたデータの中にも、核などにある類似の配列をmtDNAと混同して登録しているものがある可能性もあり注意が必要である(Wenger & Gassmann 1995)。実験的には、mtDNAの精製に注意を払うことで解決される(Beckman et al. 1993)。

　MHC[目次へ]
免疫組織に関係する遺伝子が、ゲノム上に固まってかなり大きな部分を占めている部分は、主要組織適合複合体(Major Histocompatibility Complex)と呼ばれ、略してMHCと表記されている。抗原抗体反応を発現させる遺伝子の部位で、生物自身による個体自身を認識する機能と深い関係があり、また病気に対する抵抗性にも関係があるという(鷲谷・矢原 1996）。多型性が高い。ネズミが配偶者を選ぶ際、MHCのDNA型が異なる個体を好むという方向もある(Lennington 1994)。今までは、ヒトとネズミについての研究がほとんどだが、ライオンの個体群構造の解析では、DNA指紋法などと対照させて有効なことが示されている(O'Brein et al. 1996)。個体差や遺伝的多様性にとって、生物学的に明らかな意味のある部分であり、今後鳥類を含めたいろいろな動物で、細胞の問題から社会性の問題まで応用可能だろう(Edwards 1994, Lennington 1994, 鷲谷・矢原 1996)。
生物学的に意味のはっきりした部位であり、かつ多様性に富んでいることから、今後の研究成果を著者も期待したい部位である。

　　　　　　　　　V. 倫理的な配慮と対策[目次へ]
遺伝子操作は、未知の生物をつくりだし危険な病原菌などを発生させる危険性や、医療においては産む子の意図的な選択ができるというような、生命観をくつがえしかねない技術と、密接につながっており、研究を進める上で倫理的な問題への配慮をさけて通れない研究分野である。
野鳥のDNAを扱う研究では、それほど深刻な課題を抱えることはないまでも、実験動物の人道的な扱いが一部の世論として根強く提示されているように、研究対象の生物への影響についても十分に配慮すべきである。また、生態や行動の側面を少しでも扱うような研究においては、捕獲や資料（血液などの体組織）の採取が、多かれ少なかれ少なかれ個体の状態に影響を与える。その影響が、時には研究結果自体の信頼性を損ねることに配慮すべきである。これは、どんな研究においてもだいじな留意事項である。個体識別したウグイスにおいて、月に２回程度の捕獲・採血を２～３カ月続けた結果、著しく捕獲率が低下し、少なくとも調査者の存在や捕獲という調査方法に対する行動が著しく変わった（清水　私信）。そのような配慮は、鳥類（野生動物）の研究に対する社会的な理解を得る上でも不可欠であり、自分一人だけの問題だと誤解してはいけない。
鳥類の研究における倫理的な問題については、アメリカ鳥学会(1988)やAnimal Behaviour誌の特集(1991)が参考になる。前者では、例えば採血に関して、採血自体は個体への影響がほとんどないが、100g未満の小型種では26ゲージ以上の細い針を使う、１度の採血では、全血の10 - 20%（脂肪がない状態の体重のだいたい 1.5 - 2.5%）を越えない量を採血する、など具体的な指針を含んでいる。後者では、適切で必要十分な質と数のサンプルをとるように心がけるべきことなど(Still 1991)、動物行動の研究上の倫理問題と対応の仕方を広く取り上げている。
ただし、こうした問題は、文化的・歴史的な背景に強く影響された主観的な判断を多く含む。上記２つの文献の主張にも、私が疑問に思うことが少なくない。研究の価値を問う部分も当然ながら含まれ、研究者としては悩む要素がたくさんある。細かい点まで共通の結論を出すことは、研究の自由にとってよいことではない。自分の研究方法について疑問を持たれたときに、最低限、自分なりにきちんと説明できるように、日頃から考えて（思い悩んで）おくべきだろう。
かすみ網などで鳥を捕獲する場合には、なるべく早く網からはずして迅速に作業すべきことはいうまでもないが、採血作業をともなうとどうしても作業時間が長引く。著者のコゲラの調査の場合、標識・測定・採血・写真撮影のすべての作業に1羽あたり約30分を要する。網のそばで見張っていて捕獲直後に作業を開始しても、つがいでいっしょにかかった場合には、後の個体は１時間余り拘束することになる。作業途中で、他のつがいの個体が捕獲されたり、他種がかかってしまい放鳥するために、さらに長い時間拘束する結果となることもたまにあった。この間、鳥にはかなりのストレスがかかり(Wingfield et al. 1995)、また昼間の１０分の１前後の採食時間を奪うことにもなる。こうした影響を少しでも補償するために、私は鳥に糖蜜液を与えている。ミールワームのような固形の食物は、鳥が拒絶して、無理に食べさせようとするとかえってストレスを与え、余分の時間をかけることにもなる。糖蜜液ならば、コゲラとウグイス（雄）の数十羽での経験では、ほとんどの個体が飲んだ。作業の初期に与えた方が、よく飲む。捕獲の（みかけ上の）影響には、種間差や個体差が著しくある。作業後に動けなくなってしまうような個体では、放鳥後に捕食される危険もあるので、暗く静かな場所にしばらく休ませてから放鳥するといった処置に効果がある。

　　　　　　　　　VI. DNA研究の今後[目次へ]
実験操作の自動化や、ゲノムの解読の進展にともなって、手法としてはPCR-ダイレクトシークエンス法が主流になっていくだろう。その場合に、分析対象部位として可能性の大きいものが、マイクロテライトとMHCではないか。鳥類のマイクロサテライトやMHCの研究成果は、まだわずかしか報告されてないが、現在、少なくともマイクロサテライトの研究はさかん進んでいるようである(Avise & Hemmrick 1996)。鳥類のマイクロサテライト用のプライマーはニワトリ(Cheng et al. 1995)やホオジロ科(Hanotte et al. 1994)などで、報告が出始めており、イギリスの T. Burkeのグループなどいくつかの拠点を中心に多くが開発されているという（永田私信）。鳥類の特定のグループに特異的な遺伝子あるいはDNAは、ときどき報告されており(Avise & Aquadro 1987, Longmire et al. 1988)、そういった塩基サイトの近くのイントロンに適当なマイクロサテライトのVNTRがあるのかもしれない。マイクロサテライトのためのプライマーを開発することは、絶滅危惧種の保護にとっても一定の意味があるので(鷲谷・矢原 1996)、日本でも国や自治体の保護事業としても進められることが期待される。　生態学的な研究にともなってDNA分析を行うことの大きな目的として、系統解析（類縁関係や起源の推定・進化の歴史の解明・原始形質と派生形質の区別）と遺伝学的解析（遺伝的多様性の評価・個体群の遺伝的構造の理解・遺伝的構造の変化の予想）に大きく分類したが、より具体的な研究目的にとっての応用範囲は広い。　たとえば、渡り鳥の研究では、足環標識による方法は、非常に低い回収率ともあいまって限界が低いし、近年の衛星を利用した追跡などは利用できる情況が限られている。繁殖地と、越冬地や中継地と推測される場所の周辺で、研究対象とする鳥のDNAが採集できれば、その遺伝的構造（多型性）から両者の関係を推定できる可能性がある(Avise 1994)。　前述の分子遺伝学的研究例で紹介したように、DNA多型における変異は、個体群ごとに異なり、現時点ではmtDNAを中心とした研究が多いものの、もっと多様性の高い部位も低い部位も存在する。対象とする種（鳥類でかなり共通する可能性がある）に適切な多様性のある部位の多型をもとに、繁殖地のDNA多型の集合を識別できれば、そのDNA多型の特徴を持った集団が越冬地や渡りの中継地でも検出できる可能性は高い。一般的には、繁殖地の集団が越冬地で無作為に混じっている場合は少ないと仮定してよいであろう。
　生存率や適応度を評価する上で、しばしば齢査定が重要になるが、性成熟後の齢査定は足環等で標識した個体を長期間追跡する必要があり、難しい。非常に突然変異率の高い部位がゲノムに存在し、個体内でもゲノムは変異を持っているといえる(Hayakawa et al. 1992)ので、こうした現象を利用すれば、外観では難しい齢査定(Matsuoka 1983)のようなことにも応用できる可能性がある。個体内の細胞間のゲノムの多様性自体が、そうした指標となるかもしれない。
化石や博物館標本、ミイラ、遺跡の出土品などからDNAを抽出して分析する研究も進んでいる(Avise 1994)。生きている生物体だけでなく、生体由来のあらゆる組織に含まれるDNAが研究の対象になり得る。PCR-ダイレクトシークエンス法がさらに普及すれば、例えば卵の殻（外套膜）から孵化した雛の性比を評価したり、糞や換羽の羽毛などを試料として遺伝的構造の解析するなど、生活史のあらゆる側面にDNA分析を応用して、多量のデータを得られる可能性が拓ける。要は、知りたいことをできないと諦めてしまわず、どうしたらよいか、いずれできるようになる方法も含めて想像しておき、それに備えて試料を準備しておいてもよいのではないだろうか。
　日本列島や太平洋地域の鳥類も、生物地理学的・進化論的に興味深い多くの特徴をもっているが（Higuchi et al. 1995, Higuchi & Kawaji 1989, 樋口 1996)、ある意味で、東アジアは現代生態学・進化学のフィールドワークの空白地帯になっている（図６）。例えば、オオトラツグミ(Zoothera major / Z. dauma amami)は、生物地理学的にもたいへん興味深く、日本でもっとも絶滅の恐れの高い鳥であり（石田 1995）、別種とすべき根拠が多い（石田・樋口 1990, Sibley & Alquist 1990)が、従来トラツグミの亜種とされてきて、まだ分類学的な位置が確立されていない。こういった種（個体群）の分類群としての定義、個体群構造、絶滅確率などをはっきりさせるために、DNA分析の手法にも多くが期待される。今後、生物多様性の評価や絶滅危惧種の保全にかかわる研究者は、分子生物学的な研究への理解がよりいっそう求められることになるだろう。

添付資料1.[目次へ]
◎野外で鳥類から採血するのに必要な道具や保存液
　鳥類の赤血球には多量の核DNAが含まれており、良質の血液資料を利用できることは、鳥類の生態をDNAを使って研究する上で有利な点である。
採集道具など：キャピラリーチューブ（小鳥）またはシリンジ（大型）、キャピラリーチューブはヘパリン処理した製品が凝血しにくく使いよい。ヘパリンがPCRを阻害する場合が報告されているが、ヘパリン分解酵素で除去できる(Beutlerら 1990)。プレインのキャピラリーチューブを2%EDTA-Na溶液で洗って表面にEDTA処理してもよいが、なかなかうまくできず、採血時に凝血してしまうことが多かった。
注射針(鳥の大きさによって異なる、小鳥では25-26ゲージ程度、数字が大きいほど細くなる）マイクロチューブ（小鳥の場合2cc程度の大きさが便利、Oリングの入ったスクリューキャップ式が保存に確実）
止血剤（ボスミン）・脱脂綿・栄養剤（糖蜜の濃いものなどを、例えば鳩用の「V・サイン」） ◎推奨できる血液の保存液 (lysus buffer) の成分(Seutinら 1991: 少なくとも半年くらいは常温で保存できる。）
0.01M Tris , 0.01M NaCl, 0.01M EDTA, 1% n-lauroylsarcosine (C[15]H[29]NO[3]), pH約7.5

添付資料2.[目次へ]
◎DNA-DNA交雑法をもとにした世界の鳥のリストの最新情報
　Sibley & Alquist (1990) をもとに、Sibley & Monroe (1994)や、その後の分子遺伝学的研究成果を取り入れた最新の情報が、フロッピーディスクで配布されています。リストだけならば、インターネットのホームページ、"http://wwwis.cs.utwente.nl:8080/deby/SM/sm.html"に、Unix, DOSの圧縮版（それぞれ148.895、148.685bytes)とASCIIコードの(636.456 bytes)などが掲示してある。
◎この電子本の内容についての問い合わせやコメントはシブレイ自身が、(sibley@sonoma.edu)で受け付けている。
◎電子本の問い合わせ先は、Thayer Birding Softwre, P.O.Box 43243, Cinicinnati, OH 452343, USA. Fax(513)561-4486, E-mail: 74644.2577@compuserve.com, Web Page: www.birder.com。価格は、US$75.00+$10.00(送料・梱包料)。

　　　　　　　　　謝辞
　まもなく70回を越える鳥のセミナーを私と一緒に主催し、そこでの私の発表をきっかけに本稿を書くことを勧めて山階鳥類研究所報告編集委員会に紹介してくださった上田恵介博士に深甚なる感謝を述べたい。また、２年近く延ばしてしまった脱稿を、辛抱強く待ち厳しく、優しく催促してくださった編集の岡奈理子博士、ならびに短期間に原稿をみて適切な助言をしてくださった校閲者の方々に、心より御礼申し上げる。永田尚志博士、窪川かおる博士、矢原徹一博士他、全部名前をあげることのできない多く方たちに、著者の誤解・理解不足をいろいろな形で助けていただいた。また、三中信宏博士の主催するメーリングリスト・エボルブ、山本進一博士の主催する同じくジェコネットに多くの方が書かれた記事は、日頃直接研究上の議論ができる機会の少ない職場にいる私に計り知れない知的刺激を与えている。両氏ならびに、そして、日頃、書き込み記事を通して私に多くを啓示してくださっている多くの方々にこの機会を使って感謝申し上げる。
　なお、本文でもちいた鳥の和名は、主に吉井(1988)を参照し、そこに出ていないものは内田・島崎(1987)を参照した。
図1. シルスイキツツキ類の分布(Howell 1952をもとに描く）。daggettiは、頬に白色部が多く南方に分布するムネアカシルスイキツツキ(ruber)の変種。
図2. シルスイキツツキ類の分子系統樹の例(Cicero & Johnson 1995をもとに描く）。
図3. アメリカコガラとカロライナコガラの分布と遺伝的な変異を調べた資料の最終地点(Gillら 1993をもとに描く）。アメリカコガラでは、ニューファウンドランド島の個体群だけ異なっている。カロライナコガラでは、東西の個体群が遺伝的に分かれている。
図4. ベニヒワとコベニヒワにおける、いろいろな集団単位の個体間の遺伝的な距離。塩基置換率ごとの頻度分布で表されている(Seutin et al. 1995 をもとに描く)。
図5. PCRの原理(主にTaylor 1993 をもとに描く）。
図6. オオアカゲラの亜種の分布(Ishida 1990）。日本列島の周辺で、多様な形態が見られる。亜種は、1, Dendrocopos(Picoides) leucotos leucotos; 2, lilfordi; (3), uralensis; 4, subcirris; 5, stejnegeri; 6, namiyei; 7, tangi; 8, fohkiensis; 9, insularis; 10, owstoni. 亜種の生物学的な意味や、ここに示した亜種区分の妥当性については議論の余地があるものの、日本列島の周辺で形態的な変異が大きく、島嶼に生息する小個体群があることなど、興味深い。

印刷原稿訂正表(行数の"^"は、「下から」）
p.53 ^l.6 鷲谷・矢原 1996)。　<--　谷・矢原　1996）。
p.56 l.1 Cicero & Johnson (1995) <-- Cirero & Johnson (1996)
p.57 図2　"ruber x nuchalis" [italic] <-- "ruber x nuchalis" [normal]
p.58 ^l.4 支持されなかった。 <-- 支持されなかった（図4）。
p.59 ^l.9　18S rRNA <-- 18S rDNA
p.70 l.3　DNA, 4種類のdDTP <-- DNAの4種類のdDTP
p.73. l.18 松岡 <-- Matsuoka
p.79 l.9　柴谷篤弘 <-- 柴田篤弘
p.76 l.2 evolutionary <-- eovlutionary
p.76 ^l.17 藤永[かおり=草かんむりの下に恵の旧字体]編 <-- 藤永　編
関連するページ：河田雅圭さん『はじめての進化論』改訂版テキストページ